INTRODUCCIÓN
Esta coloración, ideada por Hans Chistian Gram a fines del siglo XIX, permite dividir a las especies bacterianas en dos grandes grupos: aquellas que toman el colorante básico, cristal violeta (gram positivas) y aquellas que son decoloradas por el alcohol-acetona (gramnegativas). El procedimiento clásico de la coloración de Gram incluye la fijación del material, ya sea por calor en la llama del mechero o por acción del alcohol. Luego de la fijación, el primer paso de la coloración de Gram es la aplicación del cristal violeta; a continuación se agrega como mordiente la solución de yodo de Gram que fija químicamente el colorante alcalino a la pared bacteriana. La etapa de decoloración permite distinguir los gérmenes Gram positivos de los Gram negativos.
Es probable que por el mayor contenido en lípidos de las paredes celulares de las bacterias gram negativas, el alcohol o la acetona aumenten la permeabilidad de la pared y el colorante sea eliminado. Además, la presencia de un mayor número de
residuos de ácido teicoíco con uniones cruzadas en las bacterias Gram positivas es posible que aumente la fijación del cristal violeta. Los microorganismos gram positivos que han perdido la integridad de su pared celular debido a un tratamiento con antibióticos, envejecimiento o acción de enzimas auto líticas también permiten el escape del cristal violeta en la etapa de la decoloración. A esta altura de la coloración, los organismos gram positivos retienen el cristal violeta mientras que las gram negativas permanecen sin teñir. El agregado de un colorante de
contraste como safranina teñirá a estos microorganismos y células (leucocitos y eritrocitos) de un color rosado o rojo. Las levaduras también son gram positivas, aunque el micelio de los hongos toma la coloración de Gram en forma variable.
DESARROLLO
1.- Sobre un portaobjetos limpio y seco, se coloca una gota de solución salina fisiológica o una gota de agua.
2.- Se esteriliza el filamento del asa de siembra a la llama del mechero y se deja enfriar. Se toma una pequeña cantidad de un cultivo bacteriano y se resuspende en la gota de agua o solución salina del portaobjetos. También puede ser utilizada una aguja de inoculación estéril para tomar la muestra bacteriana.
3.- Se deja secar al aire y luego se fija a la llama del mechero, pasándolo de 4 a 5 veces sobre esta; teniendo cuidado de no calentar demasiado pues el portaobjetos puede romperse (no es vidrio pyrex). Tener cuidado al fijar el frotis para evitar quemaduras.
4.- También se pueden realizar frotis del material directo de las muestras clínicas (exudados faríngeos, heridas). Se hace rodar el hisopo con que se tomó la muestra sobre el portaobjetos limpio y se fija con calor para proceder a la tinción.
a.- Cubrir el frotis bacteriano con cristal violeta durante 1 minuto. Enjuagar con agua.
b.- Aplicar el yodo gram y dejarlo reaccionar durante 1 minuto. Escurrir.
c.- Ahora, decolorar con la solución de alcohol-acetona, agregando gota a gota en el portaobjetos inclinado sobre el fregador (o tarja), hasta que deje de salir colorante. Enjuague.
d.- Finalmente cubrir el frotis con la solución de safranina y dejarla actuar durante 1 minuto. Lavar el exceso de colorante y dejar secar al aire.
e.- Coloca aceite de inmersión al frotis seco y teñido para observarlo al microscopio, con el objetivo de 100X.
f.- Realiza esquemas de lo observado e indica la forma, agrupación y característica tintorial de los microorganismos observados.
Esta coloración, ideada por Hans Chistian Gram a fines del siglo XIX, permite dividir a las especies bacterianas en dos grandes grupos: aquellas que toman el colorante básico, cristal violeta (gram positivas) y aquellas que son decoloradas por el alcohol-acetona (gramnegativas). El procedimiento clásico de la coloración de Gram incluye la fijación del material, ya sea por calor en la llama del mechero o por acción del alcohol. Luego de la fijación, el primer paso de la coloración de Gram es la aplicación del cristal violeta; a continuación se agrega como mordiente la solución de yodo de Gram que fija químicamente el colorante alcalino a la pared bacteriana. La etapa de decoloración permite distinguir los gérmenes Gram positivos de los Gram negativos.
Es probable que por el mayor contenido en lípidos de las paredes celulares de las bacterias gram negativas, el alcohol o la acetona aumenten la permeabilidad de la pared y el colorante sea eliminado. Además, la presencia de un mayor número de
residuos de ácido teicoíco con uniones cruzadas en las bacterias Gram positivas es posible que aumente la fijación del cristal violeta. Los microorganismos gram positivos que han perdido la integridad de su pared celular debido a un tratamiento con antibióticos, envejecimiento o acción de enzimas auto líticas también permiten el escape del cristal violeta en la etapa de la decoloración. A esta altura de la coloración, los organismos gram positivos retienen el cristal violeta mientras que las gram negativas permanecen sin teñir. El agregado de un colorante de
contraste como safranina teñirá a estos microorganismos y células (leucocitos y eritrocitos) de un color rosado o rojo. Las levaduras también son gram positivas, aunque el micelio de los hongos toma la coloración de Gram en forma variable.
DESARROLLO
1.- Sobre un portaobjetos limpio y seco, se coloca una gota de solución salina fisiológica o una gota de agua.
2.- Se esteriliza el filamento del asa de siembra a la llama del mechero y se deja enfriar. Se toma una pequeña cantidad de un cultivo bacteriano y se resuspende en la gota de agua o solución salina del portaobjetos. También puede ser utilizada una aguja de inoculación estéril para tomar la muestra bacteriana.
3.- Se deja secar al aire y luego se fija a la llama del mechero, pasándolo de 4 a 5 veces sobre esta; teniendo cuidado de no calentar demasiado pues el portaobjetos puede romperse (no es vidrio pyrex). Tener cuidado al fijar el frotis para evitar quemaduras.
4.- También se pueden realizar frotis del material directo de las muestras clínicas (exudados faríngeos, heridas). Se hace rodar el hisopo con que se tomó la muestra sobre el portaobjetos limpio y se fija con calor para proceder a la tinción.
a.- Cubrir el frotis bacteriano con cristal violeta durante 1 minuto. Enjuagar con agua.
b.- Aplicar el yodo gram y dejarlo reaccionar durante 1 minuto. Escurrir.
c.- Ahora, decolorar con la solución de alcohol-acetona, agregando gota a gota en el portaobjetos inclinado sobre el fregador (o tarja), hasta que deje de salir colorante. Enjuague.
d.- Finalmente cubrir el frotis con la solución de safranina y dejarla actuar durante 1 minuto. Lavar el exceso de colorante y dejar secar al aire.
e.- Coloca aceite de inmersión al frotis seco y teñido para observarlo al microscopio, con el objetivo de 100X.
f.- Realiza esquemas de lo observado e indica la forma, agrupación y característica tintorial de los microorganismos observados.
